Vacina é o início da real luta contra o novo coronavírus: Evolução viral sob pressão seletiva

Mutações no novo coronavírus (SARS-CoV-2) continuam se acumulando e sendo reportadas por cientistas no mundo inteiro. A primeira mutação na proteína Spike (S) que causou preocupação foi a D614G, a qual hoje já é dominante na pandemia (1), compreendendo já pelo menos 80% dos casos de infecção. Porém, no geral, trabalhos acadêmicos têm considerado o SARS-CoV-2 como um vírus de RNA de relativa baixa taxa de mutação, sugerindo pequena probabilidade de preocupantes cenários observados, por exemplo, com o vírus Influenza (2). Porém, um estudo publicado agora como preprint (ainda não revisado por pares) na plataforma medRvix (3) alertou que essa proposta de baixa taxa de mutação do SARS-CoV-2 é baseada apenas em deriva genética neutra. Após as campanhas de vacinação e crescente uso de terapias baseadas em anticorpos monoclonais, seleção natural começará a protagonizar o processo evolutivo desse vírus, e precisamos estar preparados para o real e eventual conflito entre humanidade e SARS-CoV-2.

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Até o momento, são quase 59 milhões de casos confirmados e mais de 1,39 milhão de mortes registradas associados à doença causada pelo SARS-CoV-2 (COVID-19), mas esses números estão subestimados, particularmente o número de casos (estimativas apontam que 5-10% da população mundial já foi infectada). E o SARS-CoV-2 não se limitou apenas a hospedeiros humanos. Vários outros mamíferos comprovadamente são suscetíveis ao vírus, incluindo gatos, cães, primatas, e, especialmente, martas (gênero Mustella) (4). Nesse sentido, à medida que o vírus vai se alastrando e criando potenciais novos reservatórios naturais, cada vez mais mutações (deleções, substituições, edições endógenas, recombinações) vão se acumulando e potencialmente se tornando mais prevalentes via mecanismos evolutivos de seleção natural e de deriva genética.

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O SARS-CoV-2 é comumente considerado de adquirir mutações mais lentamente do que outros vírus de RNA. No entanto, o fardo mutacional do SARS-CoV-2 e taxa evolucionária (1 x 10^-3 substituições por base nucleotídica por ano) têm sido estimados apenas em condições que favorecem deriva genética neutra, na ausência de forte pressão para seleção positiva (imunidade a nível populacional - natural ou via vacinas - ou outras intervenções que selecionem mutações de resistência). Em pacientes com COVID-19 previamente não-expostos ao vírus, a carga viral e o potencial de transmissão atingem um pico próximo do período de emergência dos sintomas, enquanto a resposta humoral (anticorpos) do corpo atingem um pico 10 dias depois. Portanto, a maior parte das transmissões ocorrem bem antes de uma robusta resposta de anticorpos pelo corpo, sugerindo limitada evasão imune do vírus antes de ser transmitido para outras pessoas - ou seja, não existe suficiente pressão seletiva para o vírus evoluir resistência contra anticorpos neutralizantes.

Portanto, a atual taxa evolucionária do SARS-CoV-2 (baseada primariamente em deriva genética neutra) pode subestimar o potencial evolucionário do vírus de evadir anticorpos neutralizantes empregados como profiláticos (vacinas e terapias). Sob a pressão seletiva de um amplo emprego de profiláticos baseados em anticorpos neutralizantes, seleção a nível populacional para variantes do vírus capazes evadir com eficiência anticorpos e manter competência de infecção pode resultar em um rápido ressurgimento de massivas infecções pelo SARS-CoV-2 e engatilhamento de uma nova pandemia.

Existem dois fatores chaves que influenciam a taxa de evolução sob seleção natural nos vírus e outros organismos patogênicos: taxa de mutação e tolerância mutacional. Apenas taxa de mutação não é suficiente para predizer o sucesso de um vírus de evadir o sistema imune, porque nada adianta se muitas mutações favoráveis à evasão imune emergirem em um curto espaço de tempo mas prejudicarem a capacidade de infecção ou de transmissibilidade do vírus (custo evolucionário).

Vários profiláticos contra a COVID-19 (e algumas terapias) focam explicitamente na proteína S, responsável por se ligar ao receptor proteico ACE2 na célula hospedeira. A imunodominância do domínico de ligação ao receptor (RBD) dessa proteína na resposta imune natural - cerca de 90% dos anticorpos neutralizantes se ligam a esse região - implica que mesmo vacinas baseadas em tecnologia tradicional (vírus enfraquecido ou inativado) irão visar a porção RBD. Mutações no domínio RBD, portanto, podem potencialmente evitar o ataque (evadir) de anticorpos neutralizantes, tornando o corpo de indivíduos já previamente infectados ou imunizados novamente suscetíveis ao vírus.

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Nesse sentido, no novo estudo publicado na medRvix, e conduzido por pesquisadores Norte-Americanos - incluindo da Universidade de Harvard e do Instituto de Tecnologia de Massachusetts (MIT) -, três questões foram exploradas:

> Qual é o custo evolucionário das mutações de evasão imune associadas à região do domínio RBD da proteína S?

> Dado o custo evolucionário, o quão provável é o cenário onde pacientes infectados com o SARS-CoV-2 carregarão mutantes virais como a cepa viral dominante capaz de evadir anticorpos profiláticos monoclonais únicos ou combinados antes mesmo dessas intervenções serem empregadas?

> O quão rápido variantes capazes de evadir anticorpos monoclonais únicos ou combinados se tornarão fixas na população, uma vez que essas intervenções sejam amplamente empregadas como profiláticos?

Para responder essas perguntas, os pesquisadores realizaram uma revisão da literatura acadêmica, usaram robustos bancos de dados genômicos das cepas virais do SARS-CoV-2 já sequenciadas, e empregaram modelos computacionais (algoritmos) baseados em teoria evolucionária. Para a primeira questão, os resultados mostraram que existe um baixo custo evolucionário para a emergência de mutações de resistência imune associadas à região RBD. De fato, em vários reportes de experimentos in vivo e in vitro com variantes diversas do domínio RBD têm mostrado que o SARS-CoV-2 consegue manter uma efetiva ligação proteína S-ACE2, portanto retendo o potencial de infecção humana. Além disso, os modelos evolucionários mostraram que mutações espontâneas em cruciais porções superficiais da proteína RBD (resíduos de epítopos) podem ser capazes de tornar vários anticorpos neutralizantes SARS-CoV-2-específicos inefetivos.

Dois exemplos práticos ilustrando essa situação são a mutação N439K (5) - já presente em 12 países - e a mutação 453F (6), ambas associadas à região RBD. A mutação N439K teve origem de pessoas infectadas, está se espalhando rápido pela Europa, e dificulta a capacidade de anticorpos neutralizantes de atacar o vírus, incluindo aqueles presentes no plasma convalescente de pessoas recuperadas. Já a mutação 453F emergiu de martas infectadas em fazendas na Dinamarca, e está associada a cepas virais capazes de reinfectar humanos e de reduzir a eficácia da atividade de anticorpos neutralizantes gerados como resposta a outras cepas, expressando inclusive resistência à neutralização.

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No caso do potencial dos infectados carregarem variantes de evasão imune antes dos métodos profiláticos serem empregados, os pesquisadores encontraram que a maioria dos anticorpos neutralizantes são suscetíveis a pelo menos uma mudança de nucleotídeo-único (letra genética) resultando em evasão, sugerindo que cada mutação pontual pode corresponder à evasão de um anticorpo produzido pelo corpo. Considerando essa premissa, os pesquisadores investigaram uma faixa populacional de infecções ativas em um dado momento (5 milhões a 640 milhões) e uma faixa de custos adaptativos de transmissão para cada mutação antes do amplo emprego de uma vacina ou profilático anticorpo-baseado ou desenvolvimento de imunidade natural.

Ao longo de um espectro de custos adaptativos e começando de um número de infecções ativas menor do que o atual número na prática, os pesquisadores encontraram que mais de 10 mil indivíduos infectados com o vírus carregariam uma sequência viral dominante capaz de evadir um anticorpo. Esse número excede, de longe, o número de indivíduos requerido para ultrapassar a barreira na qual seleção natural e não deriva genética se torna o principal condutor da evolução viral. Considerando 14% da população mundial recebendo um profilático efetivo, 10 ou mais indivíduos infectados com uma variante de evasão seriam suficientes para permitir que seleção positiva expandisse essa variante e superasse a competição com as cepas selvagens. Caso mais de uma mutação fosse necessária para conferir resistência ao anticorpo profilático, a prevalência de sequências permitindo evasão diminuiria drasticamente. Porém, para um plausível número de 50 milhões de infectados ativos ao redor do mundo - número que ainda pode subestimar o real valor hoje -, centenas de indivíduos na população podem carregar essas mutações duplas, engatilhando seleção positiva.

Indo nesse caminho, se mais de duas mutações forem requeridas para o vírus escapar da neutralização por um anticorpo, seria pouco provável que uma resistência à neutralização emergisse em um curto período de tempo. Na verdade, não é esperado de existir uma significativa frequência de 4 ou mais mutações de evasão imune em uma mesma cepa viral, considerando uma taxa de mutações previamente ao amplo uso de anticorpos profiláticos.

Investigando mutações de evasão imune - combinadas ou únicas - emergindo e se tornando prevalentes após o emprego em massa das intervenções profiláticas, os pesquisadores encontraram que para mutações duplas, considerando tamanhos pandêmicos de 40 milhões ou mais, resistência ao emprego de uma ampla combinação profilática irá ocorrer dentro de meses. No entanto, mutações triplas e quádruplas irão demorar muito mais tempo para se estabelecerem a nível populacional, mesmo se anticorpos neutralizantes forem usados amplamente e exercerem forte pressão seletiva para essas mutações.

Porém, os pesquisadores mostraram que se as taxas de mutação do SARS-CoV-2 para variantes de evasão imune sob pressão seletiva forem tão altas quanto 1 x 10^-3 por transmissão (para cada indivíduo infectado), resistência pode emergir em um tempo relativamente curto mesmo para combinações de anticorpos requerendo a aquisição de 4 mutações. Aliás, uma variante associada ao RNA polimerase dependente do SARS-CoV-2-RNA (RdRp) aumenta a taxa de mutação do SARS-CoV-2 em 2-5 vezes, para um nível similar ao observado no HIV e no vírus Influenza, e já foi isolada em amostras clínicas. Em um cenário de forte pressão seletiva, mutações como essa podem se tornar rapidamente comuns.

Em outras palavras, com base em modelos teóricos e nas mutações já sendo observadas na prática sob o cenário de deriva genética neutra, é provável que o SARS-CoV-2 irá evoluir rapidamente resistência a anticorpos neutralizantes visando a região RBD, sem perder significativa eficácia de infectividade e transmissibilidade, sob o cenário de pressão seletiva. Aliás, pelo menos 120 mutações associadas a evasão imune já foram identificadas em análises genômicas ao redor do mundo, e com algumas delas já representando significativa parcela dos infectados em certos países, como a mutação N501Y.

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A partir dessa conclusão, os pesquisadores no novo estudo sugeriram estratégias para o desenvolvimento de profiláticos que sejam mais resistentes à evolução viral:

- Primeiro, os tão promissores anticorpos monoclonais para o tratamento de casos leves a moderados de COVID-19 deveriam ser usados em combinações, preferencialmente visando mais de dois epítopos não-sobrepostos. Por exemplo, a empresa farmacêutica Eli Lilly está desenvolvendo e testando apenas um único anticorpo monoclonal (LY-CoV555) (Primeiro medicamento reportado efetivo para casos leves e moderados de COVID-19) - e se usado isolado pode ficar suscetível à evasão do SARS-CoV-2. No geral, estratégias para o desenvolvimento de anticorpos monoclonais e vacinas devem envolver combinações de anticorpos neutralizantes que se liguem a regiões não-sobrepostas, incluindo agrupamentos distintos fora da região RBD.

- Segundo, o uso prático de anticorpos neutralizantes profiláticos deve ser balanceado com a extensão do emprego desse profilático. Quanto mais amplamente empregado, e mais efetivo ele for, mais rápido irá gerar resistência.

- Terceiro, a efetividade de uma estratégia profilática baseada em anticorpos imunizantes para o controle da pandemia - vacinas e/ou terapias - irá depender de quantas diferentes combinações de anticorpos serão empregadas, quantas mutações serão requeridas para evadir cada coquetel terapêutico, e a extensão na qual as mutações de evasão se sobrepõem.

Segundo finalizaram os pesquisadores, nós estamos no começo de um sério conflito existencial com o SARS-CoV-2, e é a habilidade do vírus de evoluir sob pressões de seleção que irá determinar a efetividade dos nossos esforços de controle da doença, não o simples desenvolvimento de uma ou outra vacina ou terapia.

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ATUALIZAÇÃO (29/12/20): Um estudo mais recente, também publicado como preprint na plataforma bioRxiv, mostrou, através de experimentos in vitro (culturas virais) simulando constante pressão seletiva, que a introdução de duas mutações no SARS-CoV-2 - E484K e uma inserção de 11 aminoácidos entre as posições Y248 e L249 no loop NTD N5 (248aKTRNKSTSRRE248k) - foi suficiente para permitir ao vírus evasão imune mesmo de um potente soro policlonal visando múltiplos epítopos neutralizantes. Enquanto a mutação E484K tem emergido em várias linhagens ao redor do mundo, as preocupantes novas variantes primeiro detectadas no Reino Unido (linhagem B.1.1.7) e na África do Sul (linhagem 501Y.V2) trazem a substituição E484K e também deleções dentro ou próximo de loops no NTD. O achado reforça, mais uma vez, que devemos estar preparados para variantes do vírus que podem ser selecionadas pela imunidade adquirida (rebanho) a partir de infecções naturais ou vacinas.

ATUALIZAÇÃO (20/03/21): A variante de preocupação Sul-Africana (B.1.351) tornou a vacina de Oxford (AZD1222) ineficaz contra a prevenção de COVID-19 leve a moderada. Para mais informações: Vacina da Oxford não possui eficácia contra a variante Sul-Africana na prevenção de COVID-19 leve a moderada, indica estudo

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> E fica aqui novamente o alerta: O fator evolução viral reforça a importância do controle epidêmico - uso de máscaras, distanciamento social, etc. -, para desacelerar a emergência de novas mutações e preservar o máximo possível a eficácia das vacinas sendo testadas. Quanto mais infectados, maior o nível de mutações de evasão imune, e mais fácil para a seleção natural agir. E esses esforços não-farmacológicos de controle epidêmico devem persistir mesmo após o início das campanhas de imunização.

> (2) O vírus da gripe (Influeza) possui uma alta taxa de mutação, e dois principais mecanismos evolutivos são responsáveis pela necessidade de novas vacinas a cada 6 meses: deslocamento antigênico e, principalmente, deriva antigênica. Na deriva antigênica, pequenas mutações nos genes do RNA viral visando estruturas proteicas na superfície das partículas virais vão se acumulando com o tempo até um ponto onde anticorpos produzidos previamente no corpo das pessoas não mais conseguem reconhecer a nova cepa viral resultante. No deslocamento gênico, uma abrupta mudança no vírus Influenza A gera novas cepas virais irreconhecíveis para o nosso sistema imune, engatilhando potenciais pandemias. É um processo comum quando um vírus Influenza A de outros animais ganham a capacidade de infectar humanos. Um exemplo é a emergência do vírus H1N1, acumulando genes de humanos, porcos e aves, e causando a pandemia de 2009.

Referência: https://www.cdc.gov/flu/about/viruses/change.htm

> Importante também lembrar que existem evidências de seleção positiva nas mutações D614G, S477N, A222V e V1176F, mas a maior parte do aumento de frequência em mutações diversas parece estar sendo causado apenas por deriva genética.

> Boa parte das mutações (deleções, substituições, edições endógenas, recombinações) do SARS-CoV-2 e de outros vírus ocorre durante o processo de transcrição e replicação do RNA viral (via complexo replicase–transcriptase), onde erros acabam ocorrendo na formação da sequência genética, como a introdução de uma letra/base nitrogenada errada (A, G, C ou U). Porém, evidências mais recentes sugerem que danos (ex.: oxidação) e edições endógenas (ex.: enzimas antivirais) são a forma dominante de mutações do SARS-CoV-2 intra-hospedeiro, resultando em típicas assimetrias na cadeia genética do vírus. Quanto mais o vírus se dissemina e se replica, mais erros e danos ao RNA viral podem ocorrer, e mais mutações.

(1) Publicação do preprint: https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.11.17.20233726v1.full.pdf