Técnica revolucionária agora permite ver átomos individuais em uma proteína

Em dois estudos publicados como preprint (ainda não revisados por pares) (1-2), mas já amplamente repercutidos na comunidade científica e mais do que bem recebidos, pesquisadores do Instituto Max Planck para Biofísica Química e um grupo de pesquisadores Britânicos e Holandeses reportaram pela primeira vez uma real resolução atômica em proteínas. Em outras palavras, os pesquisadores conseguiram visualizar átomos indivíduos na estrutura tridimensional dessas macromoléculas. O feito que pode revolucionar o campo da Bioquímica - especialmente Farmácia e Medicina - foi alcançado via otimização da técnica de microscopia eletrônica-criogênica (Cryo-EM) - ou microscopia crio-eletrônica.

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ATUALIZAÇÃO (22/10/20): Ambos os estudos foram publicados agora, após revisão por pares, no periódico Nature: 

• https://www.nature.com/articles/s41467-020-15894-6
• https://www.nature.com/articles/s41586-020-2833-4

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A Cryo-EM é um poderoso método analítico usado para resolver as estruturas tridimensionais de macromoléculas biológicas, e hoje já bastante popular em pesquisas (ganhando inclusive o Prêmio Nobel de 2017). Na Biologia, aplicações da cryo-EM cobrem uma amplo espectro, desde imagens de secções intactas de tecidos e células congeladas até a imagem de bactérias, vírus e partículas proteicas individuais. Com mais de uma década de contínuo aperfeiçoamento, a técnica consiste basicamente no congelamento de uma solução aquosa contendo inúmeras partículas da estrutura orgânica alvo e a resolução dessa última com um feixe de elétrons acelerados - voltagens tipicamente de 80-300 kV -, os quais atravessam a amostra, são espalhados e são subsequentemente focados via lentes eletromagnéticas. A resolução é diretamente influenciada pelo comprimento de onda da fonte radiativa - quanto menor esse comprimento (maior frequência) maior a resolução possível - e pelo número de imagens geradas para o processamento do modelo tridimensional

No caso específico de proteínas, a principal vantagem dessa técnica em relação a outra técnica bastante usada para a resolução de estruturas moleculares proteicas (cristalografia de raio-X) é que não há necessidade de cristalizar a proteína alvo. Apesar do uso de raios-X (curtíssimo comprimento de onda e alta frequência) permitir a resolução atômica das proteínas, cientistas podem gastar anos até fazer uma proteína se cristalizar, e muitas importantes proteínas em pesquisas na área de bioquímica não são capazes de formar cristais úteis. Já a Cryo-EM só necessita que a proteína esteja em uma solução purificada, aumentando de forma dramática o espectro de proteínas que podem ser analisadas e sem necessidade de longas esperas para análises. Apesar disso, existe um grande entrave nessa técnica: não conseguir resolução atômica.

Avanços de hardware e de software nos últimos anos permitiram melhoras substanciais na resolução de estruturas Cryo-EM, no entanto a maioria das estruturas proteicas resolvidas ainda permaneciam no regime de resolução de 3-4 Å (Å é um comprimento de onda equivalente a 10^-10 metros; a luz visível usada em microscópios ópticos fica na faixa de 4000-7000 Å; o raio-X chega a alcançar comprimentos de até 0,1 Å). Avanços pontuais permitiram mais recentemente uma faixa de resolução de 2-3 Å, e alguns poucos exemplos a resoluções melhores do que 2 Å. O recorde alcançado foi de 1,54 Å, na resolução da estrutura de uma apoferritina (forma livre da proteína de reserva de ferro encontrada em todas as células do corpo humano, especialmente no fígado). No entanto, essas resoluções não permitem a direta visualização das posições de átomos individuais, algo essencial para melhor estudar as propriedades catalíticas das proteínas e das suas capacidades de interação com compostos diversos. Um átomo individual, incluindo sua eletrosfera, possui uma dimensão em torno de 1 Å.

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Nesse sentido, em dois estudos publicados na bioRxiv, os cientistas reportaram finalmente ter quebrado a barreira atômica com a Cryo-EM, alcançando resoluções de 1,2-1,25 Å. No primeiro estudo (1), pesquisadores Alemães reportaram uma resolução de 1,25 Å da estrutura de uma apoferritina com o desenvolvimento de um novo microscópio eletrônico associado à técnica. A resolução da estrutura de apoferritina obtida mostrou ter quase o dobro de conteúdo informacional tridimensional do atual recorde mencionado (1,54 Å). Pela primeira vez foi possível ver átomos individuais com a Cryo-EM em uma proteína, ver densidade para átomos de hidrogênio e modificações químicas de átomos únicos. Aliás, na cristalografia com raios-X (onde fótons e não elétrons são usados) é muito difícil ver átomos de hidrogênio devido ao poder limitado do espalhamento de fótons pelo único elétron presente na eletrosfera desse elemento. Na Cryo-EM o espalhamento dos elétrons é devido ao potencial nuclear (interação com o núcleo do átomo, onde ficam os prótons e nêutrons - um único próton no caso do hidrogênio).

No segundo estudo (2), pesquisadores Britânicos e Holandeses demonstraram que com o uso de uma nova fonte de elétrons, um novo filtro de energia e uma nova câmera (Falcon-3) foi possível obter a resolução de 1,7 Å para uma proteína da membrana prototípica humana, o receptor homopentâmero β3 GABAA. Tal resolução e mapa derivado permitiu um entendimento bem mais detalhado da coordenação de pequenas moléculas, visualização de moléculas de solventes e conformações alternativas para múltiplos aminoácidos, assim como a construção não-ambígua de cadeias ácidas laterais ordenadas e de glicanos. Aplicando a nova estratégia de processamento de imagens em uma apoferritina oriunda de ratos, os pesquisadores conseguiram uma resolução de 1,2 Å, permitindo um detalhamento atômico ainda maior dessa proteína em relação ao estudo anterior e batendo um novo recorde de resolução. 

Em ambos os estudos os pesquisadores afirmam que o limite de 1 Å pode ser quebrado via Cryo-EM com a próxima geração de detectores que possibilitarão melhorar a velocidade e qualidade da detecção de imagens. A escolha da apoferritina para os testes de limite de resolução é devido à alta estabilidade dessa proteína. Resoluções atômicas com Cryo-EM para macromoléculas pouco estáveis como a GABAA é bem mais complicado mesmo com grandes avanços na área.

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Segundo um artigo publicado na Nature comentando os dois estudos (3), é provável que agora a técnica de microscopia crioeletrônica se torne a ferramenta de primeira escolha para estudos estruturais, especialmente na indústria farmacêutica. Mas a cristalografia de raios-X está longe de ser abandonada, porque é mais prática e processa estruturas de forma mais rápida. Na Cryo-EM é ainda necessário horas a dias para gerar dados suficientes para estruturas tridimensionais de altíssimas resoluções. 

(1) Publicação do estudo: bioRxiv

(2) Publicação do estudo: bioRxiv

(3) Referência adicional: Nature